О нашем центре
Новости
Информация для пациентов
Информация для врачей
Информация для руководителей
Наши технологии обучения
Компьютерная эргономика
Изданные нами книги
Форум
Карта сайта

Дембский Леонид Константинович

Google




Врачу Написать нам письмо На главную страницу

Метод определения свободного и связанного оксипролина в сыворотке крови
Кафедра биохимии Ижевского медицинского института

Исследование оксипролина в биологических жидкостях дает информацию о состоянии обмена коллагена при заболеваниях, сопровождающихся деструктивными процессами в соединительной ткани (коллагенозы, опухоли костной ткани, заживление ран) [1, 2]. Однако такие исследования в условиях клиники проводятся редко, что связано с недостаточной точностью трудоемкостью и длительностью воспроизведения существующих методов [1, 6]. Целью настоящей работы было создание доступного для клинических лабораторий метода одновременного определения свободного и связанного оксипролина в сыворотке крови.

В работе использовании принцип окисления оксипролина хлорамином Б или окисления с парадиметиламинобензальдегидом [18].

Реактивы.

(1) 8,5 М (57%) хлорная кислота, (2) 1 М (6%) трихлоруксусная кислота, (3) 3 мМ (около 0,1%) раствор фенолфталеина в 16,1 М этаноле, (4) 6 М раствор едкого натра, (5) 0,26 М (около 7%) раствор хлорамина Б или Т (стоек до 7 дней), (6) 0,67 М (около 10%) раствор парадиметиламинобензальдегида в 16,1 М этаноле (стабилен до 15 дней), (7) 16,7 М этанол, (8) смесь четыреххлористого углерода и н-бутанола в отношении 1:3, (9) растворы, содержащие 0,04, 0,08, 0,16 и 0,24 мкМ оксипролина в 4 мл (мол. Масса оксипролина 131 дальтон).

Ход исследования.

В 3 центрифужные пробирки наливали по 1 мл исследуемой сыворотки или плазмы крови, 0,05 мл хлорной кислоты и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирок перемешивал, нагревали в течение 75-80 с в кипящей водяной бане, охлаждали до 18-220С и центрифугировали в течение 5-6 мин при 3000 об/мин. Надосадочные жидкости количественно переносили в мерные центрифужные пробирки, 1-ю пробирку с содержимым ставили в воду со льдом или ее содержимое нейтрализовали как указано ниже, а 2-ю и 3-ю пробирки закрывали ретинальными каплеуловителями (часовым стеклом, центрифужной пробиркой), ставили в кипящую водяную баню на 40 мин и охлаждали до 18-220С. Содержимое пробирок после добавления к ним по одной капле раствора фенолфталеина нейтрализовали 6 М раствором едкого натра, добиваясь появления устойчивой слабопурпурной окраски по всему объему жидкости. В случае появления интенсивной окраски в смесь добавляли каплю хлорной кислоты и вновь нейтрализовывали ее щелочью (при завершении нейтрализации раствора щелочь лучше переносить на кончике стеклянной палочки). Объем жидкости всех пробирок доводили до 3,8-4,0 мл.

К 3 пробам (1я и 2я пробирки опытные, 3я - контрольная) при перемешивании добавляли по 0,5 мл раствора хлорамина, а через 4-4? мин в опытные пробы - 0,5 мл хлорной кислоты и 0,5 мл реактива № 6, а в контрольную пробу - 0,1 мл хлорной кислоты и 0,5 мл этанола. Все смеси перемешивали, нагревали в течение 75 - 80 с на водяной бане, охлаждали до 18-220С и добавляли по 4 мл реактива № 8. Содержимое пробирок тщательно встряхивали, центрифугировали в течение 10 мина при 3000 об/мин и супернатант фотометрировали при длине волны 560 … в кюветах с длиной оптического пути 2 см. Содержимое 1й пробирки фотометрировали против реактива №8 и содержимое 2й пробирки против контроля, где отсутствует характерных для оксипролина хромоген. Содержание свободного (пробирка №1) и суммарного (свободного и связанного, пробирка № 2) оксипролина рассчитывали по калибровочной кривой и выражали в микромолях на 1 л сыворотки крови (при дефиците сыворотки крови можно вести исследование только одного из этих показателей.) По разности содержания свободного и суммарного оксипролина находили количество связанного оксипролина.

Обработку сыворотки крови нагреванием и смесью кислот проводили с целью исключения влияния низкомолекуляных оксипролинсодержащих биополимеров на результаты определения. Отсутствие белков в надосадочной жидкости и свободного оксипролина в осадке устанавливали методами гельфильтарции на сефадексе G-25 и равновесного диализа. Полноту гидролиза оксипролинсодржащих полипептидов надосадочной жидкости, которые не осаждаются в условиях наших опытов, находили путем определения оксипролина через различные сроки от начала гидролиза в течение времени (16ч), которое используется для гидролиза полипептидов и белков [3, 4].

Проводили сравнительное исследование различных форм оксипролина изложенными и известными методами [4, 6] в бычьей сыворотке крови с добавлением в ней определенных количеств оксипролина, а также триптофана и тирозина, которое в условиях определения оксипролина образуют окрашенные хрмогены [2, 3]. Из таблицы видно, что предлагаемым методом по сравнению с известными методами различные формы оксипролина определяются с большей точностью. На величину последнего триптофан и тирозин практически не оказывают влияния.

Описанный метод был использован для определения свободного и связанного оксипролина 10 интактных крыс, 12 крыс с введением токсических доз антагониста витамина К - пелентана (40 мк/кг ежедневно, 15 дней) и 10 крыс с асептическими подкожными гранулемами (через 3 дня после имплантации им по 6 ватных шариков) В сыворотке крови у крыс этих 3 групп обнаружили соответственно 13,7±0,23, 24,9±1,40 и 22,1±2,33 мкмоль/л свободного и 7,4±0,32, 9,9±0,41 и 26,2±2,36 мкмоль/л связанного оксипролина.

По данным литературы [6], в сыворотке крови кроликов в среднем содержится 8,4 мкмоль/л свободного оксипролина. Сведений о содержании оксипролина, связанного с полипептидами, которые не осажадются смесью хлорной и трихлоруксусной кислоты, нами в литературе не обнаружено. Предлагаемым методом в сыворотке крови у 10 здоровых людей (возраст 18-30 лет) обнаружили 12,2±0,49 и 8,6±0,34 мкмоль/л свободного и связанного оксипролина соответственно.

Таким образом, предлагаемый метод является более информативным, требует меньше времени и может быть рекомендован для применения в клинических лабораториях.


Содержание различных форм оксипролина (в мкмоль/л) в сыворотке крови (X±m)

Условия опыта Свободный оксипролин Оксипролин полипептидов, не осаждаемых смесью хлорной и трихлоруксусной кислот Метод (литературы)
Бычья сыворотка 14,5±0,061
9,9±0,250
21,3±0,051
-
Предлагаемый
[6]
- 27,5±0,674 [4]
Бычья сыворотка с добавлением 7,634 мкмоль/л оксипролина 22,1±0,030
16,8±0,633
29,0±0,030
-
Предлагаемый
[6]
- 33,6±0,530 [4]
Бычья сыворотка с добавлением 0,98 мкмоль/л триптофана 15,2±0,061
21,3±0,572
22,1±0,091
-
Предлагаемый
[6]
- 59,5±0,732 [4]
Бычья сыворотка с добавлением 1,2 мкмоль/л тирозина 14,5±0,030
16,7±0,503
22,0±0,061
-
Предлагаемый
[6]
- 43,5±0,664 [4]


[к началу раздела]
© 2010 КРМЦРЗ Перепечатка информации возможна только при использовании активной ссылки на сайт