Исследование оксипролина в биологических жидкостях дает информацию о состоянии обмена коллагена при заболеваниях, сопровождающихся деструктивными процессами в соединительной ткани (коллагенозы, опухоли костной ткани, заживление ран) [1, 2]. Однако такие исследования в условиях клиники проводятся редко, что связано с недостаточной точностью трудоемкостью и длительностью воспроизведения существующих методов [1, 6]. Целью настоящей работы было создание доступного для клинических лабораторий метода одновременного определения свободного и связанного оксипролина в сыворотке крови.

В работе использовании принцип окисления оксипролина хлорамином Б или окисления с парадиметиламинобензальдегидом [18].

Реактивы.

(1) 8,5 М (57%) хлорная кислота, (2) 1 М (6%) трихлоруксусная кислота, (3) 3 мМ (около 0,1%) раствор фенолфталеина в 16,1 М этаноле, (4) 6 М раствор едкого натра, (5) 0,26 М (около 7%) раствор хлорамина Б или Т (стоек до 7 дней), (6) 0,67 М (около 10%) раствор парадиметиламинобензальдегида в 16,1 М этаноле (стабилен до 15 дней), (7) 16,7 М этанол, (8) смесь четыреххлористого углерода и н-бутанола в отношении 1:3, (9) растворы, содержащие 0,04, 0,08, 0,16 и 0,24 мкМ оксипролина в 4 мл (мол. Масса оксипролина 131 дальтон).

Ход исследования.

В 3 центрифужные пробирки наливали по 1 мл исследуемой сыворотки или плазмы крови, 0,05 мл хлорной кислоты и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирок перемешивал, нагревали в течение 75-80 с в кипящей водяной бане, охлаждали до 18-220С и центрифугировали в течение 5-6 мин при 3000 об/мин. Надосадочные жидкости количественно переносили в мерные центрифужные пробирки, 1-ю пробирку с содержимым ставили в воду со льдом или ее содержимое нейтрализовали как указано ниже, а 2-ю и 3-ю пробирки закрывали ретинальными каплеуловителями (часовым стеклом, центрифужной пробиркой), ставили в кипящую водяную баню на 40 мин и охлаждали до 18-220С. Содержимое пробирок после добавления к ним по одной капле раствора фенолфталеина нейтрализовали 6 М раствором едкого натра, добиваясь появления устойчивой слабопурпурной окраски по всему объему жидкости. В случае появления интенсивной окраски в смесь добавляли каплю хлорной кислоты и вновь нейтрализовывали ее щелочью (при завершении нейтрализации раствора щелочь лучше переносить на кончике стеклянной палочки). Объем жидкости всех пробирок доводили до 3,8-4,0 мл.

К 3 пробам (1я и 2я пробирки опытные, 3я - контрольная) при перемешивании добавляли по 0,5 мл раствора хлорамина, а через 4-4? мин в опытные пробы - 0,5 мл хлорной кислоты и 0,5 мл реактива № 6, а в контрольную пробу - 0,1 мл хлорной кислоты и 0,5 мл этанола. Все смеси перемешивали, нагревали в течение 75 - 80 с на водяной бане, охлаждали до 18-220С и добавляли по 4 мл реактива № 8. Содержимое пробирок тщательно встряхивали, центрифугировали в течение 10 мина при 3000 об/мин и супернатант фотометрировали при длине волны 560 … в кюветах с длиной оптического пути 2 см. Содержимое 1й пробирки фотометрировали против реактива №8 и содержимое 2й пробирки против контроля, где отсутствует характерных для оксипролина хромоген. Содержание свободного (пробирка №1) и суммарного (свободного и связанного, пробирка № 2) оксипролина рассчитывали по калибровочной кривой и выражали в микромолях на 1 л сыворотки крови (при дефиците сыворотки крови можно вести исследование только одного из этих показателей.) По разности содержания свободного и суммарного оксипролина находили количество связанного оксипролина.

Обработку сыворотки крови нагреванием и смесью кислот проводили с целью исключения влияния низкомолекуляных оксипролинсодержащих биополимеров на результаты определения. Отсутствие белков в надосадочной жидкости и свободного оксипролина в осадке устанавливали методами гельфильтарции на сефадексе G-25 и равновесного диализа. Полноту гидролиза оксипролинсодржащих полипептидов надосадочной жидкости, которые не осаждаются в условиях наших опытов, находили путем определения оксипролина через различные сроки от начала гидролиза в течение времени (16ч), которое используется для гидролиза полипептидов и белков [3, 4].

Проводили сравнительное исследование различных форм оксипролина изложенными и известными методами [4, 6] в бычьей сыворотке крови с добавлением в ней определенных количеств оксипролина, а также триптофана и тирозина, которое в условиях определения оксипролина образуют окрашенные хрмогены [2, 3]. Из таблицы видно, что предлагаемым методом по сравнению с известными методами различные формы оксипролина определяются с большей точностью. На величину последнего триптофан и тирозин практически не оказывают влияния.

Описанный метод был использован для определения свободного и связанного оксипролина 10 интактных крыс, 12 крыс с введением токсических доз антагониста витамина К - пелентана (40 мк/кг ежедневно, 15 дней) и 10 крыс с асептическими подкожными гранулемами (через 3 дня после имплантации им по 6 ватных шариков) В сыворотке крови у крыс этих 3 групп обнаружили соответственно 13,7±0,23, 24,9±1,40 и 22,1±2,33 мкмоль/л свободного и 7,4±0,32, 9,9±0,41 и 26,2±2,36 мкмоль/л связанного оксипролина.

По данным литературы [6], в сыворотке крови кроликов в среднем содержится 8,4 мкмоль/л свободного оксипролина. Сведений о содержании оксипролина, связанного с полипептидами, которые не осажадются смесью хлорной и трихлоруксусной кислоты, нами в литературе не обнаружено. Предлагаемым методом в сыворотке крови у 10 здоровых людей (возраст 18-30 лет) обнаружили 12,2±0,49 и 8,6±0,34 мкмоль/л свободного и связанного оксипролина соответственно.

Таким образом, предлагаемый метод является более информативным, требует меньше времени и может быть рекомендован для применения в клинических лабораториях.